琼脂糖凝胶电泳的关键因素

用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。

② 缓冲液系统 

缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。

常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。

TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍0.5×工作溶液即能提供足够缓冲能力。

③ 凝胶的制备

以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。

④ 样品配制与加样

DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25％溴酚蓝或其他指示染料，含有10％-15％蔗糖或5％~10％甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5％Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。

⑤ 电泳

琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA段的zui大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。

电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5％时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。

⑥ 染色和拍照

常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。