1、背景
氨甲酰磷酸是生物合成代谢中精氨酸与嘧啶的重要前体物质，在工业微生物生产精氨酸与嘧啶及其衍生物中发挥关键作用。
2、目的
在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中比较氨甲酰磷酸不同合成途径的催化效率。
3、方法
在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中过表达鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)的基础上，分别过表达大肠杆菌自身的氨基甲酸激酶(CK)和氨甲酰磷酸合酶(CPS Ⅱ)并表征其反应效果。通过优化底物供应(调整底物浓度与引入L-谷氨酰胺合成酶)对CK与CPS Ⅱ的催化反应进行优化。
4、结果
在大肠杆菌中过表达OTC，建立细胞水平氨甲酰磷酸检测体系。在此基础上比较不同来源的CK，发现大肠杆菌来源的CK效果最好，50 mmol/L NH4HCO3条件下全细胞催化9 h得到2.95±0.15 mmol/L L-瓜氨酸；过表达CPS Ⅱ时，50 mmol/L L-谷氨酰胺催化9 h得到3.16±0.29 mmol/L L-瓜氨酸。通过改变底物NH4HCO3浓度和引入外源L-谷氨酰胺合成酶(GS)等方式对CK与CPS Ⅱ的催化反应分别进行优化后，100 mmol/L NH4HCO3条件下，L-瓜氨酸浓度分别提高至4.67±0.55 mmol/L和6.12±0.38 mmol/L，且过表达GS后CPS Ⅱ途径可以利用NH3，不需要额外添加L-谷氨酰胺。
5、结论
【结论】引入L-谷氨酰胺合成酶后的CPS Ⅱ途径合成氨甲酰磷酸的能力优于CK途径，为精氨酸、嘧啶及其衍生物的合成提供了一种更加高效的策略。
图1 氨甲酰磷酸的不同合成途径与L-瓜氨酸合成途径
Figure 1 Different carbamoyl phosphate synthetic pathways and L-citrulline synthetic pathway
图2 SDS-PAGE分析不同来源CK的蛋白表达(A)与催化能力比较(B)
Figure 2 SDS-PAGE analysis of expressions of CKs from different species (A) and comparison of catalytic capacity of CKs (B)
图3 SDS-PAGE分析CPS Ⅱ的蛋白表达(A)与催化效果(B)
Figure 3 SDS-PAGE analysis of expression of CPS Ⅱ (A) and catalytic effect (B)
图4 NH4HCO3浓度对菌株ECFI合成氨甲酰磷酸的影响
Figure 4 Effects of different concentrations of NH4HCO3 on synthesizing carbamoyl phosphate by strain ECFI
图5 引入两岐双岐杆菌来源GS对CPS Ⅱ途径的影响(A)，以及降低L-谷氨酰胺添加量对菌株GSABFI的影响(B)
Figure 5 The effect on CPS Ⅱ synthesis with the introduction of GS from Bifidobacterium bifidum (A), and the effect of reducing the amount of L-glutamine on the strain GSABFI (B)
图6 两种合成氨甲酰磷酸途径的比较
Figure 6 Comparison of two carbamoyl phosphate biosynthesis pathways